以多巴（L-DOPA）为底物

以多巴（L-DOPA）为底物，柚皮测定酪氨酸酶的苷氢活性。先将待测样品用无水乙醇溶解，抗氧配制成质量浓度为1Mg/ML的化活贮备液，再依次稀释成不同浓度的性研样品溶液。按表2所示，柚皮依次准确吸取不同浓度的苷氢样品溶液，pH6.8的抗氧0.5MoL/L磷酸盐缓冲溶液，0.5MMoL/LL-DOPA溶液和0.15Mg/ML酪氨酸酶溶液，化活充分混匀，性研在37℃水浴锅中孵育反应30MiN，柚皮然后立即测定各试管中反应溶液在475NM处的苷氢吸光值。上述试验均重复3次。抗氧根据酶反应活性的化活定义，在一定的性研抑制剂浓度下，酶反应活性表示为ACTi，在没有抑制剂时酶反应活性表示为ACT0，则受试样品对酶的相对抑制率（I）可以定义为：
 

式中，ACTi—有抑制剂时的酶反应活性；ACT₀—没有抑制剂时的酶反应活性；A₁，A₂，A₃，A₄—1，2，3，4号反应液的吸光值。

1.2.7 B16黑色素瘤细胞细胞MTT试验

称取50g重铬酸钾固体，以100ML蒸馏水100℃溶解（电炉加热），快速加入900ML浓H₂sO₄，混匀，冷却即可使用。MTT用PBs配制成质量浓度5Mg/ML，过0.22μM水相滤膜后存于10ML无菌离心管中，于-20℃冷冻保存。具体步骤：

1）取柚皮苷、NariNgiNDC和熊果苷的标准品

20Mg，加入DMsO溶解配成500MMoL/L的母液，过0.22μM有机滤膜后以每管20μL分装于无菌的200μL离心管中，于-20℃冷冻保藏。

2）不同浓度样品的配制

分别取柚皮苷、NariNgiNDC和熊果苷3种物质500MMoL/L的母液各4μL，加入4ML1640基础培养基中，配成500μMoL/L的溶液，然后分别稀释到250，125，62.5μMoL/L3个浓度。

3）96孔细胞培养板培养细胞

在超净工作台中移取5ML75T细胞培养瓶终止消化后的细胞与培养液的混合液于离心管中，800r/MiN离心4MiN，弃上清液，移取3ML完全培养基于离心管并混匀细胞液，取上述1ML细胞液，加1ML完全培养基，取80μL于平板计数器计数，用完全培养基稀释调整细胞浓度为8000个细胞/100μL，用12通道移液枪将细胞液混匀，加入96孔细胞培养板，每孔加入100μL，做好标记后将细胞培养板放入CO2恒温培养箱培养24h。

4）96孔细胞培养板中加入样品

将上述96孔细胞培养板放入CO2恒温培养箱培养24h，用废液真空泵吸弃细胞培养液，每孔加入不同浓度的样品150μL，并且每块96孔板都要留1到2列只加基础培养基做空白对照，做好标记后将细胞培养板放入CO2恒温培养箱培养24h。

5）B16黑色素瘤细胞的MTT试验

在超净工作台中，取PBs配成质量浓度5Mg/ML的MTT溶液，与基础培养基以体积比1∶9的比例配成MTT细胞培养液。将步骤4）中加样品培养24h后的细胞培养液用废液真空泵吸弃，每孔加入150μLMTT细胞培养液，做好标记后将细胞培养板放入CO2恒温培养箱培养4h，吸弃MTT细胞培养液，每孔加入150μLDMsO，于酶标仪中振动10MiN后测定波长490NM处的吸光度值。

细胞存活率=（A₀-Ax）/A₀×100%

式中，A₀—不加样品的空白吸光度值；Ax—加不同浓度样品作用后的吸光度值。

1．2.8 B16黑色素瘤细胞HoeChsT荧光染色试验

具体操作步骤：

1）于超净工作台上，打开六孔板，置灭菌盖玻片。将细胞悬液滴加至盖玻片上，置CO2体积分数为5%的培养箱中，37℃培养至细胞固着（约2h），加入2ML细胞培养液继续培养约6h。弃培养基，用PBs洗3次，每次5MiN。

2）用4%多聚甲醛固定30MiN，PBs洗3次，每次5MiN。

3）切片稍甩干后在圈内滴加适量HoeChsT染液到爬片上，室温避光孵育15MiN。

4）PBs漂洗爬片3次，每次5MiN，从六孔板内取出爬片，将有细胞的一面封到滴加有抗荧光淬灭封片剂的载玻片上，荧光显微镜下观察并拍照。

1.2.9 NariNgiNDC与双孢蘑菇酪氨酸酶的分子对接

采用CheMBioDrawULTra14.0画出化合物熊果苷和NariNgiNDC的结构，然后用CheMBio3DULTra14.0转化为三维结构，用MMFF94力场进行优化。双孢蘑菇酪氨酸酶的三维结构（PDBiD：2Y9X）从RCsB蛋白数据库下载。酪氨酸酶和化合物均使用AuToｄoCkTooLs1.5.6转化为PDBQT格式。采用AuToｄoCkviNa1.1.2进行分子对接。酪氨酸酶活性位点的坐标设置为：CeNTer_x=-10.044，CeNTer_y=-28.706，CeNTer_z=-43.443；size_x=15，size_y=15，size_z=15。为了增加计算的准确度，将参数exhausTiveNess设置为20。其它参数均用默认值。最后，选取打分值最高的构象用PyMoL1.7.6进行结果分析。

2 结果与讨论

2.1 柚皮苷、NaringinDC、NHDC及槲皮素对ABTS自由基的清除效果

以TroLox作为对照，以其浓度-吸光值绘制标准曲线y=0.3627x+0.0661（R2=0.9943），研究柚皮苷、NariNgiNDC、NHDC及槲皮素4种样品对ABTs自由基清除效果，结果见图3。4种样品对ABTs自由基清除效果以TroLox的抗氧化物质的量表示，结果见表3。

由表3可知，4种样品对ABTs自由基均有清除作用。以TroLox作为对照，4种样品的总抗氧化能力结果中，柚皮苷的TroLox抗氧化物质的量为0.1748MMoL/g，NHDC为2.9109MMoL/g，NariNgiNDC为0.6986MMoL/g，槲皮素为39.6103MMoL/g。4种样品对ABTs自由基清除能力依次为槲皮素＞NHDC＞NariNgiNDC＞柚皮苷。

2.2 柚皮苷、NaringinDC、NHDC及槲皮素对羟自由基的清除效果

以TroLox为对照，以其浓度-吸光值绘制标准曲线y=4.0588x+0.079（R2=0.9998），研究柚皮苷、NariNgiNDC、NHDC及槲皮素4种样品对羟自由基清除效果，结果见图4。4种样品对羟自由基清除效果以TroLox的抗氧化物质的量表示，结果见表4。

由表4可看出，4种样品对羟自由基均有清除作用，试验中以TroLox作为对照，得到柚皮苷清除能力的TroLox物质的量为19.8μMoL/g，NariNgiNDC为31.9μMoL/g，NHDC为44.4μMoL/g，槲皮素为365.5μMoL/g。4种样品清除羟自由基能力依次为槲皮素＞NHDC＞NariNgiNDC＞柚皮苷。

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相关链接：柚皮苷，槲皮素，酪氨酸酶，磷酸盐

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