1.4法兰克福香肠人工污染单核细胞增生李斯特菌取同批号待检法兰克福香肠6～7袋，单核搓揉外包装，细胞性单使内容物与液体充分接触。增生珠的制备无菌开启包装，李斯链抗取浸出液40mL（每袋约6mL），特菌特异体磁混匀，单核作为待测样，细胞性单置4℃保存。增生珠的制备人工污染前，李斯链抗取1mL浸出液通过增菌培养法检测待测样。特菌特异体磁选择未受李斯特菌属污染的单核待测样，接种新鲜培养的细胞性单单核细胞增生李斯特菌（AＴCC19115），使其终浓度约为＜1CFU/mL、增生珠的制备1CFU/mL、李斯链抗10CFU/mL和100CFU/mL。特菌特异体磁污染后将样品置4℃稳定24h，模拟食用前的微生物存活状态。 1.5法兰克福香肠人工污染单核细胞增生李斯特菌和英诺克李斯特菌取40mL待测样，分别接种新鲜培养的单核细胞增生李斯特菌AＴCC19115（LM）和英诺克李斯特菌AＴCC51742（LI）。菌液终浓度LM/LI的比例分别为1/1，1/10，1/100，1/1000，10/10，10/100，10/1000，100/10，100/100和100/1000。污染后将样品置4℃稳定24h。 1.6目标菌的磁珠捕获与菌落计数1.6.1 BHI培养基中磁珠的捕获效率分别将3株单核细胞增生李斯特菌和6株其它李斯特菌属细菌接种至BHI培养基中培养（表3），制成约105CFU/mL菌液。取上述菌液1mL，分别加入20μL免疫磁珠溶液，4℃轻微振荡1h。用PBS缓冲液在磁力架上清洗3次，用1mL相同的缓冲液重悬，必要时进行10倍系列稀释。以6×6滴板计数法（每滴10μL）在BHI琼脂培养基上计数，比较磁珠捕获前后微生物的数量变化。
1.6.2法兰克福香肠中单核细胞增生李斯特菌的检测以USDA-FSIS检测方法为基础（MicrobiologyLaboratoryGuidebook，MLG8.1），结合磁珠捕获和PCR确认技术，检测法兰克福香肠中的单核细胞增生李斯特菌。取第1次增菌的UＶM培养基（Modifieduniversityofvermontbroth）90mL，加入10mL人工污染浸出液，置（30±2）℃振荡160r/min培养（22±2）h。分别取0.1mLUＶM培养物至第2次增菌的10mLFB培养基（Fraserbroth）和10mLMOPS-BLEB培养基（Morpholinepropanesulfonicacidbufferedlisteriaenrichmentbroth）中，置（35±2）℃振荡250r/min培养（26±2）h。取上述UＶM、FB和MOPS-BLEB培养物各1mL，分别加入scFv-IMBs和Dyna-IMBs溶液20μL，按1.6.1节的方法分别在BHI琼脂和显色琼脂上计数。剩余的磁珠捕获液用于显色培养基划线和细菌基因组DNA提取。 2结果2.1BHl培养基中磁珠的捕获效率采用9株细菌考察BHI培养基中两种磁珠的特异性。scFv-IMBs对3株单核细胞增生李斯特菌的捕获率在15%～55%之间，高于同种培养基中Dyna-IMBs的0.85%～1.27%捕获率。scFvIMBs除对斯氏李斯特菌和伊氏李斯特菌的捕获率略高于Dyna-IMBs外，对李斯特菌属中非单核细胞增生李斯特菌的捕获率均低于0.61%。在BHI纯培养系统中，scFv-IMBs显示出良好的特异性和较高的捕获率。 2.2备选PCR引物的验证为了从5种备选的引物中选择出单核细胞增生李斯特菌特异性PCR检测引物，针对23株待测微生物进行PCR引物验证。引物Lmo0733具有李斯特菌属水平特异性；格式李斯特菌干扰引物Aznar的检测；威尔斯李斯特菌、格式李斯特菌和部分英诺克李斯特菌干扰引物Ｊaton的检测。经试验确认的单核细胞增生李斯特菌种水平的特异性为引物Fluit和Nied（表1），这两对引物目标靶点是对李斯特菌溶血素O基因（hlyA）。由于引物Nied在51℃退火时具有较高的检测灵敏度，可检测到约2.86pg的单核细胞增生李斯特菌基因组（数据未列出），被用于后续试验的PCR检测中。 2.3法兰克福香肠中单核细胞增生李斯特菌的检测在BHI和显色培养基上计数的菌落数（或典型菌落数）分别代表了样品经UＶM、FB或MOPS-BLEB培养基培养后，所有微生物的总数和单核细胞增生李斯特菌的数量。法兰克福香肠浸出液经增菌培养后，背景菌的浓度可达到107～108CFU/mL，而单核细胞增生李斯特菌的浓度约为102～104CFU/mL，背景菌在培养物中占据主导地位（表4）。由于高浓度背景微生物影响磁珠与目标微生物的结合，导致在第一步UＶM培养基中两种磁珠的捕获率均低于5%，甚至无法在琼脂平板上分离获得目标菌。经FB和MOPS-BLEB培养基二次增菌后，单核细胞增生李斯特菌的比例由第1次增菌前不足0.01%（浓度小于104CFU/mL）迅速提升到20%～80%（浓度约为106～108CFU/mL），而背景菌的数量未见显著增加（表4）。其中，经MOPS-BLEB培养后李斯特菌属细菌的终浓度会高于FB培养基，并成为体系内优势菌，具有较好的选择培养性。
采用scFv-IMBs和Dyna-IMBs两种磁珠捕获后，通过显色培养基和PCR检测证实，磁珠捕获方法对单核细胞增生李斯特菌的灵敏度可达1CFU/mL。两种磁珠在MOPS-BLEB培养基中的捕获率（62%～88%）明显高于UＶM培养基（＜5%）和FB培养基（＜53%）中的捕获率。 声明：本文所用图片、文字来源《中国食品学报》，版权归原作者所有。如涉及作品内容、版权等问题，请与本网联 相关链接：李斯特菌，UＶM培养基，BHI琼脂 |
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